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無菌檢查與微生物檢查的一些問題解答

更新時間:2016-02-17   點擊次數:1837次

1、問: 做無菌驗證時陽性對照菌是怎么加入的?可以在加完培養基后用無菌的注射器把菌液注入嗎?

:嚴格的說是要在zui后一遍沖洗液中加入陽性對照菌的,這主要是考量濾膜對于陽性菌的截留性~但是濾器如果可以提供濾膜對于陽性菌的充分截留的話在zui后的培養體系中加入陽性菌也是未嘗不可的. 如果供試品沒有抑菌作用,可以在加完培養基后用無菌的注射器把菌液注入,搖勻如果供試品有抑菌作用,正如安哥洛卡所講,在zui后一次沖洗液中加入陽性對照菌,搖勻,抽慮,加培養基. 無菌檢查,加入陽性的方法可以有許多種,可以根據個人的習慣。只是注意:1、避免人為污染。2、陽性菌加入數量,關鍵詞:陽性對照菌

2、問: 離心沉淀法的原理、操作和注意事項是什么?

:原理:利用沉降系數的差異將供試品和微生物進行分離;

操作:取規定量的供試液,3000/分離心20分鐘(供試液如有沉淀,先以500/分離心5分鐘,取全部上清液再離心),棄去上清液,留底部集菌液約2ml,加稀釋劑至原規定量.

注意事項:真菌由于沉降系數比較小, 500r/min離心5min,黑曲霉、白色念珠菌回收率為20%,因此其檢查不適宜用低速離心沉淀法.

關鍵詞:離心沉淀法

3、問: 穩定性實驗的微生物及無菌檢查,是否每次都要做?

:;

原因: 實驗期內可能會染菌;

滅菌后微生物并不是就*"死亡",有些成為碎片,這些碎片在一定的條件和時間下,可以自我修復而復活.

穩定性的考察,也應包括藥品有效期的考察,在此期間所有的項目都應是合格的,無菌也是其中之一,如果在有效期內無菌不合格,也可以說明該藥品存在一定的缺陷,至少,有效期有問題。

關鍵詞: 穩定性實驗

4、問:眼部給藥制劑如何做衛生學檢驗?

:液體制劑:無菌檢查;

半固體及固體制劑:微生物限度檢查

關鍵詞: 眼部給藥制劑

5、問:滴眼液的微生物限度為何進行無菌檢查?

: 滴眼劑產品系按照無菌工藝生產且終產品為滅菌產品,故其成品的微生物質量應要求統一為無菌;所以,滴眼劑產品的臨床合理用藥應與其衛生標準要求一致,即將其微生物質量要求統一為無菌,顯然更為合理;

滴眼劑的微生物質量要求為無菌,是與各國藥典在滴眼劑要求上的統一,及對《中國藥典》此項規定合理性的補充及完善等方面看,滴眼劑成品的微生物質量要求統一為無菌具有必要性。

同時,中國已加入WTO,進出口藥品已有明確質量要求(在國外藥典中,眼用藥品都以無菌要求),同時臨床用藥更加合理與規范。

故現行藥典將滴眼劑的衛生標準統一為強制性無菌要求。

關鍵詞: 滴眼液 無菌檢查

6、問:如何進行滅菌驗證?

: 可用生物指示劑進行驗證,

濕熱滅菌:濕熱脂肪芽孢桿菌孢子

干熱滅菌:枯草芽孢桿菌孢子

7、問:為何潔凈度沉降菌的檢查只用營養瓊脂?

: 玫瑰紅鈉培養基對細菌的生長有抑制作用,而營養瓊脂對于真菌的生長則沒有抑制作用,所以選用營養瓊脂作為培養基

營養瓊脂主要為培養細菌,而且培養時間是2,原因為細菌為原核生物,生長與繁殖的能力較霉菌等真核生物強,所以控制了細菌,霉菌等真菌也在一定程度上也得到了控制

廠家在制定自己的內控標準時,可以同時對細菌和真菌進行控制.

關鍵詞:沉降菌

8、問: 微生物培養時間范圍如何界定?

: 含量測定所允許的誤差為±2%,如果照此限度,無菌培養時間為14*24小時/=336小時,它的2%6.72小時,前后共13.44小時;又加上無菌檢驗沒有必要達到含量測定所要求的精度,所以我們*可以在培養的第十四天的任何上班時間觀察結果下結論.微生物限度檢查培養時間分別為48小時及72小時, 它們的2%分別為0.96小時,1.44小時,即我們只能在準確培養時間的前后1~2小時內計數.

關鍵詞: 微生物培養時間

9、問:抗生素乳膏,需加聚山梨酯80、司盤、單硬脂酸甘油酯乳化,后離心集菌(離心后不分層),再薄膜過濾。但基質堵住膜孔,過濾速度非常慢,怎么辦?

答:1、可以用十六烷酸異丙酯萃取基質,使之分層,取水層進行薄膜過濾(回收率差)。

2、樣品加入吐溫-80,乳化(45度)-----薄膜過濾。

關鍵詞:抗生素乳膏、十六烷酸異丙酯、萃取、吐溫-80、乳化(45度)、薄膜過濾

10、問:陶瓦蓋作用及使用范圍

:陶瓦蓋的主要作用為防止菌落蔓延生長成片或發生重疊影響計數,通常在在效價測定中使用,在微生物限度檢查中僅在易形成片狀菌某些劑型如蜜丸、水丸中使用.

關鍵詞:陶瓦蓋

11、問:如何根據消毒物品的特性確定合格的滅菌時間和溫度?

:一般情況下,含有糖分的培養基溫度需控制在1151520min,不含糖分的培養基溫度控制在1211520min,而含菌的培養基(使用過)溫度需控制在12130min左右 ,此外每次使用時,應放入必要的監視指標。

關鍵詞:滅菌時間 溫度

12、問:如何減少培養基靈敏度下降引起的誤差? :目前大多數單位使用干粉培養基,使用較方便,但由于其極易吸潮,如存放不當出現凝塊,則其凝固性較差,應避免使用。新鮮配制的培養基應在2℃~20℃避光保存,但不得凍結,保存時間不得過2周。硫乙醇鹽流體培養基儲存過程中,若氧化還原層超過1/5,須經水浴加熱煮沸10min方可使用,但只限一次。否則可使培養基中糖、微生 物和氨基酸受到破壞,影響質量

關鍵詞:培養基靈敏度

13、問:如何控制細菌的培養時間?

:不同的培養時間對樣品細菌總數計數結果的影響 樣品經24h培養后,有的菌落很小,容易漏掉,培養48h后,菌落不但變大,而且還有很多新生長出來的菌落,培養72h后,菌落數增加不多,但菌落明顯變大,而且混雜的霉菌生長旺盛,影響結果的觀察計數。同時這也是一些樣品經72h培養后細菌總數技術有明顯增加的一個原因。培養24h和培養48h計數結果有明顯差異,后者合格率明顯降低,所以在規定的培養環境下,應嚴格遵守培養時間,以便真實的反映出樣品中細菌總數的水平。

關鍵詞:細菌 培養時間

14、問:菌種保藏與管理應執行哪些程序?

:菌種保藏與管理應有完整的程序,保藏的菌種必須具備該菌種的詳細歷史及有關資料。一般是首先填寫菌種卡片,登記菌種名稱編號,來源歷史,形態特征,生化與血清學鑒定,以及菌種傳代次數、zui宜培養基和培養條件、保藏方法、貯存條件及保藏地址等

關鍵詞:菌種保藏與管理

15、問:青霉素酶的保存條件及溫度對其活性的影響 

:青霉素酶能夠在4℃保存6 個月以上活性不發生顯著改變。與同時采用的加入甘油或增加氯化鈉濃度保護酶活性的方法比較, 沒有顯著的不同;

溫度對青霉素酶的活性影響很大。55 ℃時對青霉素G呈現zui高水解活性, 隨著溫度的升高或降低, 酶水解活性逐漸下降。緩沖液pH 對酶活性存在一定的影響, zui適酸堿度為 pH 7.0 ,在應用本酶進行青霉素制劑無菌檢查等應用時, 需特別注意測試溫度及酸堿度的影響.

關鍵詞:青霉素酶 保存

16、問:標準滅菌時間

F0=Ft * 10(t-121)/10計算,F0要大于8,在160--170度是短時間就能做到的,為什么干熱滅菌要兩小時以上呢?

答:濕熱滅菌和干熱滅菌的效果是不同的, 飽和蒸汽的穿透性比干熱空氣穿透強得多,蒸汽冷凝時放出的潛熱傳給待滅菌品,使之升溫并使待滅菌品所帶的微生物尤其是表面的微生物發生水合作用, 從而加速了它們的死亡。所以在達到同樣滅菌效果的前提下,濕熱滅菌所需要的時間要短得多。

(公式 F0=Ft * 10(t-121)/10 只適合于濕熱滅菌 ,F0T=121℃及Z=10℃下的FT值。如果把121℃理解為“標準狀態”,那么F0可理解為“標準滅菌值”)

關鍵詞:滅菌時間、濕熱滅菌、干熱滅菌

 

17、問:驗證是不是要3批樣品的一次,還是一批樣品的3次,還是3次樣品3次得實驗?

答:1、驗證的目的,是要考察實驗方法的可行性(避免出現假陽性、假陰性),

2、在樣品的藥物組成、成份、給藥途徑一致的前提下,驗證時,“同一個批號的做3次”或“3個批號的各做一次”,均可。

關鍵詞:驗證、3次、1

18、問:做實驗的好習慣是什么?

答:1.實驗前后清潔洗手,完畢清理實驗現場,器皿洗凈歸原,儀器等電源關閉。 2.試劑、樣品標簽詳細準確,包括劑量,規格,時間,實驗人員等等;實驗記錄詳細準確,以便備查和分析。 3.提前分析實驗內容及步驟,準備好全部的試劑及相應工具、儀器,不懂或者有疑問的步驟和地方問清楚,重點難點重點標出,做到心中有數;實驗完畢及時分析。 4.科學計劃、合理分配時間,做到忙而不亂。實驗中仔細觀察試驗過程,及時記錄可疑或者需要注意的地方。 5.多讀文獻多與別人交流,開拓思路,改進方案,對于實驗的進展及方向做到一定的把握。

關鍵詞:做實驗、好習慣

19、問:限度檢查所用器皿用自來水洗后一定用純化水再洗嗎?

答:GMP認證中關于QC的規程中"分析用玻璃器皿清潔規程"要求如下

1.0目的 提供玻璃器皿的清潔方法的文件指導。 2.0范圍 化驗室部門所有玻璃器皿。 3.0責任 化驗室人員。 4.0程序 4.1 玻璃器皿每次使用后,使用者必須使其清潔并放于固定位置備用。 4.2 一般玻璃器皿清潔,用飲用水或去污劑洗滌后,器壁應不掛水珠,再用少量純化水沖洗器皿三次,放固定位置自然干燥。 4.3 定量分析用玻璃器皿(如滴定管;移液管等)清潔,先把器皿內的水瀝掉,然后往其中加入洗液,浸泡一段時間,放掉洗液,用飲用水沖洗后,再用純化水沖洗三次,倒置自然干燥。 4.4 水分測定用的玻璃器皿清潔過程同12,清潔后置于105~107℃烘箱內烘干。然后存放于干燥器中。

關鍵詞:限度檢查、器皿、純化水

20、問:潔凈室甲醛氣體熏蒸消毒驗證方案是什么?

答:1 甲醛消毒方法

在所有的消毒液中甲醛zui常用。當相對濕度在65%以上、溫度在24~40℃時,甲醛氣體的消毒效果,但若采用過多的甲醛,會因聚合而析出白色粉未附在建筑物或設備表面。一般甲醛的消毒方法如下:

A:消毒前先用絲綢浸注射用水(純化水)擦洗房間建筑物和設備表面,然后用5%麝香草酚溶液噴酒或擦洗,靜置1小時后,再用絲綢浸注射用水(純化水)擦洗一次。

B:計算體積(包括房間及風管體積),按10ml/m3的比例準備濃度為36%的甲醛溶液(甲醛密度為1.1g/ml),按2~3g/m3的比例準備高錳酸鉀溶液。

C:在房間中放入試驗裝置,如不銹鋼培養皿支架;直徑90mm雙碟玻璃培養皿;枯草桿菌試紙,每張試紙上枯草桿菌數量為1*106個,每個培養皿中放2張試紙,1張做無菌試驗,1張做含菌數試驗。培養皿的數量應根據房間面積確定。

D:消毒流程:在不銹鋼容器中加入高錳酸鉀,用雙層紗布蓋住桶口,再倒入36%濃度的甲醛溶液 甲醛氣體擴散(約30min 啟動空調器讓甲醛氣體循環(約20min 關閉通風系統,房間熏蒸消毒,不少于7hr 房間排氣,用新鮮空氣置換(約2hr 開啟空調系統 75%酒精噴酒環境。

E:質監部門取樣培養。判斷標準:試紙內枯草桿菌數量小于1*103個為合格。

F:取樣后用絲綢沾0.1%的新潔爾滅溶液擦洗機器表面;用0.1%新潔爾滅溶液或1%Germ Warfare溶液或75%酒精噴灑建筑物四周。0.1%新潔爾溶液與1%Germ Warfare溶液溶液每月輪換一次。

2 氣體熏蒸滅菌后室內環境中殘留量的測試

用甲醛氣體進行熏蒸滅菌后,需用全新空氣換氣若小時,由于甲醛的環境標準只有(1~2*10-6,要使環境中的殘留的甲醛濃度盡可能低至不致使人嗅出特殊氣味(<0.55*10-6>,并對眼睛無刺激(<1*10-6>,然后根據測定的室內環境中甲醛殘留量的結果,正確設定換氣時間,以保證在達到作業環境中無菌的前提下,對人身心健康不致產生不良影響。

1 取樣方法及取樣量

在各取樣場所,用約30L的塑料袋收集室內空氣,將袋內空氣用吸收瓶、泵、氣流計等組成的裝置捕集至瓶內吸收液中(樣本數應≧3)。

2 供試液的配制

0.5%硼酸溶液20ml作為吸收液,用溶液吸收法,以1L/min的速度分別讓各取樣場所的空氣通過10min,然后將吸收液移至25.0ml的容量瓶中,加水使成25.0ml,即得。

3 試驗操作

A:取供試液2.0ml至帶栓試管中,加5mol/LNaOH溶液2.0mlAHMT溶液2.0ml,輕搖數次混勻后,室溫放置20min。然后加KIO4溶液2.0ml,搖2~5min至無氣流生成為止;同時用水2.0ml同法制成對照液,在波長550nm附近測zui大吸光度。

B:分別取甲醛標準液00.51.01.52.0ml,加水使成2.0ml,然后按A操作,測定吸光度,制出甲醛濃度(ug/ml)與吸光度的關系檢量線。

環境中的甲醛濃度(10-6)可由下式求出:

22.4 273+t

甲醛濃度(10-6=aX-------------X25X---------

30.03 273V

式中 a------供試液中甲醛濃度,

V-----采樣氣體量,L

t-----采樣時平均溫度,℃

224-----1mol氣體在01個大氣壓(101.325kPa)下的體積,L

3003---- 甲醛相對分子質量;

25-----供試液全量,ml

4 試液準備

A:甲醛標準液

a甲醛稀釋液:精取中國藥典中規定“甲醛溶液”1ml,加水準確至200 ml作為甲醛稀釋液.精取10ml至碘瓶內,確加入0.1mol/L碘液50ml,加1mol/L氫氧化鋰溶液20ml。避光放置15min后,加15ml10%硫酸,用硫代硫酸鈉液(0.1mol/L)滴定。另用水10ml進行空白試驗。

Va-VbX1.5013

甲醛稀釋液中的甲醛濃度(mg/ml=------------------------------------

10

式中Va------甲醛稀釋液消耗0.1mol/L硫代硫酸鈉液量,ml

Vb------空白試驗消耗0.1mol/L硫代硫酸鈉液量,ml

1.5013------1ml碘液(0.1mol/L)相對甲醛的量,mg

10-------甲醛稀釋液取樣量,ml

b:甲醛標準液:精取甲醛稀釋液,加水準確稀釋1000倍,即得。

BAHMT溶液

4-氨基-3--5-巰基-124-三唑0.5g,加0.2mol/L鹽酸100ml溶解,避光保存。需要說明的是,用甲醛消毒時也有不加高錳酸鉀,而將甲醛直接放入空調器內送入房間及用氨水中和的方法。不管采用什么方法,只要經過驗證是可行的,都可以使用。

關鍵詞:潔凈室、甲醛氣體、熏蒸消毒

問:細菌室工作守則(微生物室SOP之一)是什么?

答:細菌室工作守則 1.每日工作前用紫外線照射實驗室半小時以上。 2.入室前應穿工作服,并做好實驗前的各項準備工作。 3.實驗室內應保持肅靜,不準吸煙、吃東西及用手觸摸面部。盡量減少室內活動,以免引起風動,無關人員禁入。 4.非必要物品禁止帶入實驗室,必要資料和書籍帶入后,應遠離操作臺。 5.做好標本的登記、編號及試驗記錄。未發出報告前,請勿丟棄標本。 6.標本處理及各項試驗應在操作間進行,接種環用完后應立即火焰滅菌,沾菌吸管、玻片等用后應浸泡在消毒液內。 7.實驗時手部污染,應立即用過氧乙酸消毒或浸于3%來蘇兒溶液中5-10分,再用肥皂洗手并沖洗干凈;如誤入口內,應立即吐出,并用1:1000高錳酸鉀溶液或3%雙氧水漱口,根據實際情況服用有關藥物。 8.實驗過程中,如污染了實驗臺或地面,應用3%來蘇兒覆蓋其上半小時,然后清洗;如污染工作服,應立即脫下,高壓滅菌。 9.若出現著火情況,應沉著處理,切勿慌張,立即關閉電閘,積極滅火。易燃物品(如酒精、二甲苯、乙和丙酮等)必須遠離火源,妥善保存。 10.工作結束時檢查電器、酒精燈等是否關閉,觀察記錄培養箱、冰箱溫度及工作情況,用浸有消毒液的抹布將操作臺擦拭干凈,并將試劑、用具等放回原處,清理臺面,未污染的廢棄物扔進污物桶,有菌廢棄物應送高壓滅菌后處理。 11.離室前工作人員應將雙手用消毒液消毒,并用肥皂和清水洗凈。 12.愛護儀器設備,經常清潔,注意防塵和防潮。 關鍵詞:微生物室SOP

問:紫外燈管是什么玻璃材料做的?原理是什么?

答:紫外線殺菌燈基本常識 --------------------------------------------------------(彭*) ----殺菌燈實際上是屬于一種低壓汞燈。低壓汞燈是利用較低汞蒸汽壓(<10-2Pa)被激化而發出紫外光,其發光譜線主要有兩條:一條是253.7nm波長;另一條是185nm波長,這兩條都是肉眼看不見的紫外線。 ----用來照明用的日光燈、節能燈也屬于低壓汞燈,依*低壓汞蒸汽被激發后發射紫外線,其中254nm波長的紫外線照射到熒光粉上再發出可見光,如果改變熒光粉的成分和比例,它就可以發出我們通常所見的不同顏色的光。 ----殺菌燈不需要轉化為可見光,253.7nm的波長就能起到很好的殺菌作用,這是因為細胞對光波的吸收譜線有一個規律,在250~270nm的紫外線有zui大的吸收,被吸收的紫外線實際上作用于細胞遺傳物質即DNA,它起到一種光化作用,紫外光子的能量被DNA中的堿基對吸收,引起遺傳物質發生變異,使細菌當即死亡或不能繁殖后代,達到殺菌的目的。 ----日光燈和節能燈使用普通玻璃做成的,253.7nm紫外線透不出來,不能用做殺菌用的燈,石英玻璃對紫外線透過率高,達90%,是做殺菌燈的材料,但是石英玻璃的性能與普通玻璃在性能上有很大的差別(主要是熱膨脹系數不同),封接不能用普通的自動化程度較高的圓封的辦法,這使得殺菌燈生產制造的技術含量要高于普通節能燈。 ----有一種透紫外線的玻璃,即通常所說的高硼玻璃,它對紫外透過率約是石英玻璃的60%,它的生產工藝與節能燈一樣,使得它的成本與價格比石英玻璃生產的殺菌燈相差很遠,幾瓦的燈管只需幾元,但它在性能上遠比不上石英殺菌燈。表現在如下幾方面: ---- 1、透過率不同,在同樣規格經同樣鎮流器測試,石英玻璃殺菌燈紫外線強度是高硼玻璃殺菌燈的1.5倍以上; ---- 2、高硼玻璃燈紫外光強度很容易衰減,它點燈數百小時后其紫外光強度就大幅下降,降到初始時的50%-70%。在用戶手上,雖然看到燈管還是亮的,但它可能已不起作用了。而石英玻璃的光衰減程度要遠小于高硼燈,如果生產工藝過關,石英燈的光衰減在經點燈2000-3000小時,光衰減到初始時的80%-70%,以后只要燈不滅,光衰的幅度會越來越小。 ----國內殺菌燈的客戶可能會了解菲利浦的殺菌燈,菲利浦有一種殺菌燈是用一種接近普通玻璃的玻璃生產的,而非石英玻璃制造的,其透光率接近石英玻璃的透過率,比中國的高硼玻璃燈要高得多,可使用自動化程度較高的節能燈生產工藝生產,這種燈主要依*他們煉制這種玻璃的技術。它的缺點是不能產生臭氧。 ----石英殺菌燈的另一個特點是可發出臭氧。由于石英玻璃對短波185nm的紫外線透過率也高,185nm的紫外線能電離空氣產生臭氧,臭氧濃度高對人體不利,但在無人場合時能使用,臭氧也能殺菌、消毒,恰好可彌補由于紫外線只沿直線傳播、消毒有死角的缺點。 ----有些場合不能有臭氧,也可使用石英殺菌燈,這種石英玻璃在煉制的時候就加了一種元素--鈦(Ti),使它透過紫外線在200nm以下發生截止,而對254nm紫外線透過基本無影響,即通常所說的無臭氧殺菌燈。 ----從以上分析,做殺菌燈用石英玻璃是選擇。在國內,醫療衛生領域,早已不推薦使用高硼殺菌燈,在美國、加拿大、日本生產紫外線殺菌燈普遍都采用石英玻璃。原理:現代紫外消毒技術是基于現代防疫學、光學、數學、生物學及物理化學的基礎上,利用特殊設計的率、高強度和長壽命的C波段紫外光發生裝置產生的強紫外C光照射流水、空氣或固體表面,當水、空氣或固體表面中的各種細菌、病毒、寄生蟲、水藻以及其他病原體受到一定劑量的紫外C光輻射后,其細胞中的DNA結構受到破壞(鍵斷裂,或光化學反應,如使DNATHYMINE二聚等),從而在不使用任何化學藥物的情況下殺滅細菌、病毒以及其它致病體。達到了消毒和凈化的目的。

關鍵詞:紫外燈管

:直接接種法和薄膜過濾法的區別

:直接接種法取樣量少,方法繁瑣,且易受外源性細菌污染,對操作者和操作環境要求高,對實驗結果的可*性影響較大。薄膜過濾法采用大取樣量集菌的方法,具有代表性,不易漏檢,儀器操作簡單。該系統是全封閉過濾系統,避免了操作過程中外源性細菌的污染,對實驗結果的可*性影響較小。薄膜過濾法的缺限是集菌儀的價格較高,一次性使用的集菌培養器也是一項支出,所以較直接接種法而言,花費的成本要高。相對產品質量而言,增加這點投入也是應該的。

關鍵詞:直接接種法 薄膜過濾法 區別

:05版藥典關于微生物限度檢查驗證方法中提到驗證試驗至少應進行3次“獨立的平行試驗”。請問應該如何理解“獨立的平行試驗”?什么樣的情況算是“獨立平行”呢?如果設計3次試驗,試驗時間能否重疊?試驗條件能否共用?

:時間可以重疊,試驗條件也可以共用.先做一次獨立的試驗,然后后面兩次跟*次一樣. (1)試驗組:取樣品加入xxx ml稀釋液中,混勻制成供試液,取供試液1ml1ml50 100cfu試驗菌,注入無菌平皿中,做2個平行。(2)菌液組:取1ml試驗菌注入無菌平皿中,做2個平行,測定所加的試驗菌數。(3)供試品對照組:取1ml供試液注入無菌平皿中,做2個平行,測定供試品本底菌數。(4)傾注已融化并冷卻至45℃左右的xxx培養基于以上平皿中,待凝固后,倒置于xxxx℃培養 xxxh,計數。(5)試驗重復3次。

關鍵詞:獨立的平行試驗 微生物限度檢查驗證




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